光的吸收
除了在部分或透明的物質上發生折射、散射、干涉和衍射現象外，還可以產生一種顏色印象，如彩虹、蔚藍的天空、閃閃發光的肥皂泡、華麗的孔雀羽毛或薄薄的油膜和層，顏色主要通過光的吸收或反射出現在我們的環境中。

物質的“色彩"是通過選擇性吸收來自電磁輻射光譜的可見部分的光而產生的。這個范圍介于紫外線和紅外光之間。在分子水平上，這意味著分子進入電子激發態：通過吸收光量子（光子），電子從占據的最高分子軌道上移走（HOMO = h最遠 o被占用 m耳目 o比妥;能源 E1）進入最di的未占用分子軌道（LUMO= l奧韋斯特 u已占用 m耳目 o比妥;能源 E2）已提出。
 

E光子= h ? υ = (h ? c) / λ = ΔE = E 2 - E 1

E光子：光子的能量
h：普朗克常數
υ：輻射頻率
c：光速
λ：輻射波長
ΔE：兩個能級之間的能量差

被吸收的光子的能量正好對應于兩個能級的能量差，即分子只能以離散的能量狀態存在，能量被“量子化"，只能以規定的部分被吸收或釋放。


紫外/可見光譜
可以測量光的吸收 - 例如在染料溶液中 - 可以測量。定量紫外/可見光譜的基礎是朗伯-比爾定律：
 

E = lg（I0 / I） = ε ?c ? d

E：吸光度
ε：摩爾消光系數
c：濃度
d：層厚
我0：樣品前的光強度
I：樣品后的光強度

通過變換方程，得到化合物的濃度c。

c = E / （ε ? d）

蘭伯特-比爾定律適用于單色輻射。通過繪制波長上的吸光度，可以獲得不同波長的化合物的紫外/可見光譜。

朗伯-比爾定律對于高濃度溶液以及濃度依賴性反應的發生（例如 染料的聚集 代表。

當穿過溶液時，光束變弱，部分光已被溶液中的分子吸收，即忽略散射和反射：  
 

A + T = 1 = (I0 – I)/ I0 + I/ I0

A = 吸收 = 光的吸收部分 = (I 0 – I) / I 0
T = 透射 = 光的透射部分 = I / I 0

因此適用以下內容：

E = -lg (T)

Lambert-Beer 定律中的比例常數是與波長相關的材料常數，并且描述了允許激發的所謂躍遷概率。適用光譜選擇規則，即區分允許和禁止的躍遷。最重要的選擇規則是保持多重性（見下文）。允許的躍遷具有更高的躍遷概率，因此具有更高的消光系數。對于有機染料，長波吸收最大值處的消光系數值 > 10 5 L mol -1 cm -1；這些是共軛 π 系統中允許的躍遷。

吸收是一個非?？焖俚倪^程（10 -15到 10 -14秒），不會發生自旋反轉。分子通過吸收光子吸收的能量在激發態的有限壽命后以不同形式再次釋放。如果排除光化學反應，則除了以熱能形式發射之外，還可能發生熒光或磷光等發光現象。這些基本的光物理過程，其中分子的化學特性保留在最后，可以用 Jablonski 圖或 Jablonski 項圖的形式圖形表示。



其中緊挨著電子能級 S 0 – S 2和 T 1還顯示了相關的振動子級別。輻射過程（波浪線）和非輻射過程（線）之間的表示有所區別。

單線態S只有成對電子，總自旋為S = 0；三重態 T 有兩個不成對的電子，總自旋為 S = 1；這給出了多重性 M = 2 S + 1（存在磁場時的能級數）。 M = 1 for singlet states and M = 3 for triplet states. 因此，多重性守恒的選擇規則僅允許單線態或三線態系統內的轉換（“自旋禁止"）。


熒光
熒光（10 -9至 10 -7s) 表示通過從第一激發單重態 S 1的振動能級躍遷到 電子基態 S 0的振動能級 （即在等多重態之間）使受激分子失活時可觀察到的光發射（“Kasha 規則"）。因此，觀察到的熒光與激發波長無關。
 
GG Stokes 在發光礦物螢石 (CaF 2) 如此命名，可以根據經驗與有機分子的某些結構特征相關：非芳烴不顯示任何熒光；即使它們有 11 個共軛雙鍵，如番茄紅素，也不會，而芳香族化合物幾乎能夠發出熒光。

因此，在許多（如果不是全部）情況下，剛性和平面分子結構（通常是“芳烴"的情況）可能被視為良好熒光能力的先決條件。
此外，已經表明，將某些基團引入芳烴會削弱熒光。其中包括硝基，這意味著例如硝基苯不會發出熒光。

 
組合 (ISC)
然而，溴或碘原子也會降低熒光。然后人們談到了內部重原子效應。這些取代基通過更大的自旋軌道耦合促進了實際上自旋禁止的轉變為三線態系統。單重態系統和三重態系統的等能振動能級之間的這種相互轉變被稱為“系統間交叉" ( ISC) 。具有不成對電子的順磁性物質，例如分子氧 O 2，也充當介導這種轉變的催化劑。 三重態 T 1的振動基態失活中的磷光A

 

 在電子基態S 0的振動能級發生的光發射 稱為磷光。與只有在激發時才能觀察到的熒光不同，磷光也可以在激發結束后發生或持續很長時間（“余輝"）。這又與自旋禁令有關，導致三線態的壽命更長（10 -4到 10 2秒），從而延遲到單線態基態的失活。

 
斯托克斯位移
由于熒光或磷光總是來自電子激發態 S 1或 T的振動基態 v 01發生時，與激發帶相比，發射帶總是移動到更高的波長，即紅移。與熒光相比，磷光移動到更長的波長。

 
內部轉換 (IC)此外，可以發生稱為
“內部轉換"(IC) 的失活，例如，通過從第一電子激發態 S 1的振動基態 到電子基態 S 0的等能電子振動能級的轉變 .然后從這種較高的激發振動水平（10 -12s) 放出熱量。這種類型的無輻射失活總是比發光過程更快。這個過程似乎對流動性很強的分子特別有效。因此，在脂肪族化合物的情況下，人們發現幾乎是內部轉變到電子基態并且沒有熒光。在大多數其他分子中，非輻射失活過程也支配著發光過程。

 
熒光染料
只有極少數有機染料的非輻射失活速度足夠慢，足以保證激發態到基態的轉變，在這種轉變中，多余的能量通過光子的發射以熒光的形式釋放出來。
熒光染料的特征在于其光譜特性，例如激發和發射光譜、熒光量子產率 (η fl ) 和熒光衰減時間 (τ fl )。染料的熒光與激發波長無關。
選擇染料作為熒光標記時需要考慮的事項在相應部分中顯示。

 
光譜特性
熒光染料的光譜特性在很大程度上取決于分子結構。為了使分子的吸收在可見波長范圍 (400 - 700 nm) 內，基態和激發態之間的能量差必須足夠低。有機染料最顯著的結構特征是共軛π電子系統，即所謂的“發色團"（希臘色載體）。
在大多數情況下，染料的熒光光譜在一級近似下是最長波長吸收帶的鏡像，熒光通常移動 25 - 40 nm 到更長的波段。


吸收羅丹明染料
最ATTO-染料，發色團具有剛性分子骨架。許多代表屬于羅丹明染料家族。這些染料的共同結構元素是呫噸骨架中心碳原子上的羧基苯基取代基。
羧基（紅色）位于 2 位或鄰位，顯著影響所有羅丹明的物理化學性質。例如
，由于存在游離的鄰位羧基，ATTO 565和ATTO 590及其衍生物具有在處理這兩種染料時必須考慮的特殊性質。用作熒光標記的有ATTO 565和ATTO 590苯基取代基的 4 位或 5 位上的額外羧基：

  

吸收波長對 pH 值的依賴性
鄰位羧基的質子化-去質子化平衡影響羅丹明的光學性質發色團強。染料ATTO 565和ATTO 590



的吸收最大值位置對于染料的質子化和去質子化形式是不同的。例如，相對于質子化形式，通過兩個羧基的去質子化（添加三乙胺），乙醇中ATTO 565的吸收最大值移動16 nm 至更短的波（亞光）：



染料-螺內酯平衡在平衡狀態下， ATTO 565和ATTO 590
也 可以形成去質子形式的無色螺內酯：在羧酸根陰離子對中心碳進行親核攻擊的過程中形成五元環，染料的發色系統被打斷, 因此形成的化合物不再被可見光吸收并發出熒光： 螺內酯的比例或這種平衡的位置在很大程度上取決于溶劑、pH 值、溫度和染料結構。在極性非質子溶劑中，平衡幾乎位于螺內酯一側；在無水丙酮中是ATTO 565染料的溶液



因此，ATTO 590幾乎是無色的。另一方面，在水或乙醇等極性質子溶劑中，平衡——如上所述——幾乎在有色形式的一側。
 
熒光光譜在大多數情況下，染料的熒光光譜是長波吸收帶的鏡像，這里以ATTO 514
為例可以很好地看出： 熒光最大值通常偏移 25 - 40 nm與吸收最大值相比更長的波。這種所謂的斯托克斯位移



進一步受到激發態壽命期間染料周圍溶劑分子重新定向的影響，因此發射發生在較低能量的“溶劑松弛態"。激發期間電子分布變化越大，能量差就越大，因此斯托克斯位移就越大。這在我們的ATTO LS 染料中得到了實際應用。


熒光量子產率 (η fl )
熒光染料最重要的特性之一是熒光量子產率 (η fl )。量子產率描述了發射光子的比率 (n fl) 到吸收的光子數 (n abs )。

η fl = n fl / n abs

因此，熒光量子產率永遠不會超過 100%。如上所述，非輻射失活過程經常與熒光競爭，從而降低量子產率。

高熒光量子產率對于通過熒光研究染料當然是有利和可取的。我們將在別處更詳細地探討熒光量子產率
的實驗測定。熒光衰減時間 (τ fl )

 

激發后熒光光子的發射是一個統計過程。因此，單個分子保持在激發態的時間也是一個統計量。然而，如果考慮許多相同分子的集合，則會產生明確定義的衰變統計結果。在通過短激光脈沖激發后，分子數量在簡單的情況下呈指數下降。激發分子的數量 (n 1 ) 下降到 1/e 系數（約 37%）之后的時間稱為熒光衰減時間 (τ fl )。

n 1 (t) = n 1 (0) exp(- t / τ fl )

熒光衰減時間是染料的重要特性，可用于識別染料。我們的ATTO染料的 τ fl值通常在納秒范圍內。熒光衰減時間 的確定在別處描述。分子相互作用 熒光衰減時間與染料的熒光量子產率一樣，不是一個固定的量，而是受染料所處環境（即溶劑和溫度）的影響。染料的衰減時間和量子產率不是彼此獨立的，而是通過以下關系相互關聯的： τ fl







= τ 0 × η fl

τ 0是在沒有無輻射失活的情況下發生的所謂自然衰減時間(η fl

= 100%)。 因此，熒光衰減時間的變化可以提供有關染料分子局部環境變化的信息。